A TECNOLOGIA IGY VIABILIZANDO RASTREAMENTOS DA BIBLIOTECA DE CDNA DE PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS: ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE CLONES.

Ana Claudia Paiva Alegre (FMRP-USP); Fausto Bruno dos Reis Almeida (FMRP-USP); Maria Cristina Roque-barreira (FMRP-USP); Ebert Seixas Hanna (FMRP-USP)

Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, micose profunda de maior prevalência na América Latina. Estima-se que o Brasil detenha 80% dos casos de PCM, distribuídos irregularmente em áreas endêmicas, e é provável que seja a oitava causa de óbito por doenças infecto-parasitárias crônicas e recorrentes no país. Uma lectina de P. brasiliensis denominada paracoccina (70kDa), purificada por afinidade a N-acetil glicosamina, foi identificada e localizada na superfície celular. O objetivo do nosso trabalho é a identificação de moléculas presentes em uma fração purificada por cromatografia de afinidade a quitina, e uma dessas moléculas é a paracoccina, proteína multi-funcional, que apresenta atividades lectínica e enzimática (NAGase), e contribui para a adesão do fungo à matriz extracelular e induz macrófagos a produzirem TNF-α e altas concentrações de NO. O procedimento de purificação utilizando cromatografia de afinidade em coluna de quitina proporciona rendimento final de 5μg, cuja análise SDS-PAGE 12% revelou banda de aproximadamente 70kDa, correspondente a paracoccina. A coleção desse material foi necessária para a produção de anticorpos IgY, utilizados para rastreamento da biblioteca de cDNA de leveduras de P.brasiliensis em conjunto com análises proteômicas realizadas no Centro de Pesquisa em Câncer Fred Hutchinson, em Seattle (EUA), onde a identificação das proteínas foi realizada através da digestão tríptica in-solution de alíquotas liofilizadas das preparações de paracoccina. A tecnologia IgY permitiu o isolamento de clones que foram selecionados para o seqüenciamento. Nossos resultados indicaram que as preparações de paracoccina contêm outros elementos além da clássica banda de 70kDa, e destacaram o gene PADG_3347. Esse gene está relacionado com a expressão de uma proteína hipotética de P. brasiliensis, e possui sequencia traduzida homóloga às proteínas multifuncionais, com domínios atribuídos às funções lectínicas e enzimáticas. Esse resultado corrobora com o fato de que as preparações de paracoccina são purificadas por afinidade, devido a sua atividade lectínica, mas também possuem atividade enzimática comprovada, da classe das N-acetil-glucosaminidases.਀䤀渀猀琀椀琀甀椀漀 搀攀 昀漀洀攀渀琀漀㨀 䌀愀瀀攀猀 攀 䘀愀瀀攀猀瀀㰀⼀昀漀渀琀㸀㰀⼀瀀㸀㰀戀爀㸀㰀戀㸀倀愀氀愀瘀爀愀猀ⴀ挀栀愀瘀攀㨀 㰀⼀戀㸀☀渀戀猀瀀㬀䈀䤀䈀䰀䤀伀吀䔀䌀䄀 䐀䔀 挀䐀一䄀Ⰰ 䤀最夀Ⰰ 䰀䤀䜀䄀一吀䔀匀 䐀䔀 儀唀䤀吀䤀一䄀Ⰰ 倀愀爀愀挀漀挀挀椀搀椀漀椀搀攀猀 戀爀愀猀椀氀椀攀渀猀椀猀Ⰰ 刀䄀匀吀刀䔀䄀䴀䔀一吀伀 䤀䴀唀一伀䰀팀䜀䤀䌀伀㰀⼀琀搀㸀㰀⼀琀爀㸀㰀⼀琀愀戀氀攀㸀㰀⼀琀爀㸀㰀⼀琀搀㸀㰀⼀琀愀戀氀攀㸀㰀⼀戀漀搀礀㸀㰀⼀栀琀洀氀㸀