UTILIZAÇÃO DA LEVEDURA PICHIA PASTORIS NO DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA PARA PRODUÇÃO DE VIRUS-LIKE PARTICLES BASEADAS NA PROTEÍNA CAPSIDIAL L1 DE BPV 2.

Filipe Colaço Mariz (LEMTE/UFPE); Marcelo Nazário Cordeiro (LEMTE/UFPE); André Luíz Santos de Jesus (LEMTE/UFPE); Júlia Furtado Campos (LEMTE/UFPE); Eliane Campos Coimbra (LEMTE/UFPE); Antonio Carlos de Freitas (LEMTE/UFPE)

Os papilomavírus (PVs) estão dispersos entre os vertebrados e se diversificaram ao longo da história evolutiva desse grupo. São vírus que infectam queratinócitos e fibroblastos, causando tumores benignos na pele, no tecido mucoso e podendo conduzir a processos neoplásicos. O papilomavírus bovino tipo 2 (BPV 2) causa lesões cutâneas e câncer de bexiga em bovinos e sarcóide em equinos, o que resulta em prejuízos econômicos significativos aos pecuaristas. Embora não exista, até o momento, tratamento ou vacinas contra essas doenças, abordagens utilizando a expressão heteróloga da proteína L1, capaz de formar virus-like particles (VLPs), estão em uso para humanos. Neste trabalho, avaliamos a possibilidade do uso de Pichia pastoris para a expressão da proteína L1 de BPV 2. Primers específicos, contendo sítios de restrição para direcionar a clonagem em vetor de expressão pPICZA e a sequência consenso de expressão em levedura, foram desenhados para amplificar o gene L1 a partir do genoma completo de BPV 2. O produto da reação de PCR foi utilizado para clonagem no vetor pGEM-T Easy e subclonagem no vetor pPICZA, dando origem à construção pPICZAL1B2. A presença e orientação do inserto, bem como sua fase de leitura no cassete, foram analisados por PCR, digestão enzimática e sequenciamento. Esta construção foi utilizada para transformação de leveduras P. pastoris por eletroporação. Os transformantes foram semeados em placas YPDS acrescido de Zeocina e a PCR de colônia com primers complementares às regiões do vetor pPICZA que flanqueiam o inserto L1 confirmou a integração do cassete de expressão no genoma das células hospedeiras. Posteriormente, foi realizado o crescimento e induçãos em frascos dos transformantes utilizando meio com metanol a 2% por 120 horas. A partir da extração de RNA e proteína total, foram detectadas, respectivamente, a expressão do gene L1 mediante RT-PCR e a proteína L1 por meio de Dot Blot utilizando anticorpo (anti-His) contra a cauda de poli-histidina fusionada à proteína L1. Os resultados confirmam a obtenção de clones recombinantes capazes de produzir a proteína L1 de BPV 2. Este é um passo fundamental para o estabelecimento de P. pastoris como uma plataforma para a produção de VLPs, visando o desenvolvimento de estratégias vacinais contra o BPV.