CLONAGEM DO SISTEMA DE PARTIÇÃO PARB EM PLASMÍDEO DE AMPLO ESPECTRO DE HOSPEDEIRAS

Ronaldo Biondo (USP); Ilana Racowski (USP); Diogo Pinetti Marquezoni (USP); Elisabete José Vicente (USP); Ana Clara Guerrini Schenberg (USP)

 O fragmento gênico parB, originário do plasmídeo R1 de E. coli, codifica 3 genes: (i) hok (host killing), que codifica uma toxina letal, cujo RNAm é estável; (ii) mok (modulation of killing), que apresenta fase de leitura sobreposta à da sequência hok, sendo necessário para a expressão e tradução de hok, e (iii) sok (suppression of killing), que codifica um pequeno RNA anti-senso (instável) ao RNAm hok, o que bloqueia a tradução da proteína letal Hok. Quando o plasmídeo portador de parB é perdido pela célula ou ocorre falha durante a segregação, ocorre rápida degradação do RNA anti-senso sok, ocasionando a tradução do RNAm mok-hok e, portanto, a produção da toxina Hok, provocando a morte celular. Com o objetivo de aumentar a estabilidade segregacional do plasmídeo de amplo espectro de hospedeiras pCM2, construído em trabalhos anteriores do nosso grupo e que necessita de pressão seletiva para manter-se na bactéria hospedeira, foi clonado o fragmento parB, em substituição ao fragmento MOB, codificador de mobilização plasmidial em pCM2. Para tanto, a sequência codificadora de parB foi amplificada por PCR utilizando iniciadores específicos com sitos de restrição enzimática NarI e AatII (desenhados neste trabalho) e como molde o vetor pOU61. O amplicon foi clonado no vetor comercial pCR2.1TOPO e sequenciado, originando o plasmídeo pPAR. Posteriormente, o fragmento parB foi  isolado do vetor pPAR. O plasmídeo pCM2 foi digerido enzimaticamente com as enzimas NarI e AatII, o que ocasiona a liberação do fragmento MOB, e neste sítio foi sub-clonado o fragmento parB, gerando o vetor final pCM3 com dupla vantagem: (i) portador da sequência parB, codificadora de estabilidade segregacional e (ii) sem o fragmento MOB, o que evita a passagem do plasmídeo pCM3 para outras bactérias por meio de conjugação.