25º Congresso Brasileiro de Microbiologia

25º Congresso Brasileiro de Microbiologia

ResumoID:2410-1

Área: Genética e Biologia Molecular ( Divisão N )

CONSTRUÇÃO DE UM NOVO SISTEMA DE EXPRESSÃO E&NBSP; PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES BASEADA EM ESPOROS DE BACILLUS SUBTILIS.

Milene Tavares Batista (ICB-USP); Quynh Anh Nguyen (Universität Bayreuth); Wilson Barros Luiz (ICB-USP); Juliano Domiraci Paccez (ICB-USP); Luis Carlos de Souza Ferreira (ICB-USP); Wolfgang Schumann (Universität Bayreuth); Rita de Cássia Café Ferreira (ICB-USP)

Resumo

A maioria de proteínas de relevância biomédica é encontrada em baixas quantidades em suas fontes naturais. A expressão de genes heterólogos em bactérias é a forma mais simples e barata de se obter grandes quantidades de polipeptídeos almejados tanto para a pesquisa quanto para a indústria. Os maiores problemas associados à produção de proteínas recombinantes é o re-estruturamento da proteína e a perda da atividade biológica. Assim sendo, o objetivo deste trabalho foi construir um sistema de expressão baseado em esporos de Bacillus subtilis que permita a purificação de proteínas heterólogas que apresentam tendência a formar corpos de inclusão ou falta de atividade quando super expressas em Escherichia coli. Inicialmente clonamos a região N-terminal e o promotor da proteína CotB, proteína comum e de alto número na capa do esporo, em um vetor integrativo de B. subtilis, fusionada à proteína carreadora foi clonada uma mini-inteína, proteína com atividade de auto-clivagem em baixas temperaturas e pH, que permite a purificação da proteína alvo e, em seguida o gene repórter da α-amilase foi clonado em frame com a CotB::Inteína. O vetor foi integrado a uma região não essencial do B. subtilis e os esporos recombinantes foram avaliados quanto a expressão da α-amilase por meio da degradação do amido em placa e em solução. A purificação da α-amilase foi mediada pela ativação da mini-inteína após incubação dos esporos em tampão por 16 horas a 25º C. Como resultado, construímos o vetor integrativo pMTB122 e o transformamos na linhagem 1012 de B. subtilis. Em seguida, observamos que a α-amilase ligada ao esporo foi capaz de degradar o amido tanto em placa quanto em solução de forma eficiente. Por fim, a α-amilase foi purificada da superfície do esporo com a ativação da mini-inteína e separada dos esporos por centrifugação, o sobrenadante com a α-amilase purificada foi capaz de degradar aproximadamente 90 % do amido em solução. Conforme exposto, o novo sistema foi gerado com sucesso e permitiu a expressão de proteína com atividade biológica tanto na superfície do esporo como livre (após purificação). Além disso, pela primeira vez este tipo de purificação rápida e fácil foi realizada em esporos e se mostrou extremamente eficiente, abrindo novas perspectivas para proteínas que apresentam problemas de expressão nos sistemas convencionais.

Palavras-chave: Bacillus subtilis, Sistema de expressão, purificação, esporos

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