INVESTIGANDO O MECANISMO DE TRANSPORTE ATIVO DE AÇÚCARES PELA PERMEASE AGT1 DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Débora Trichez (USP); Sérgio Luiz Alves-jr (USP); Catarina Macedo de Figueiredo (USP); Luiz Claudio Miletti (UDESC); Pedro Soares de Araújo (USP); Boris Ugarte Stambuk (UFSC)

Em S. cerevisiae, a permease AGT1 é responsável pelo transporte ativo via H⁺-simporte de uma série de a-glicosídeos que são encontrados nos caldos de fermentação de relevantes processos industriais, como cervejaria e produção de álcool combustível. Condizente com a importância desse transportador para os processos fermentativos, a maioria das linhagens industriais apresenta este gene no seu genoma. Neste trabalho, investigamos o papel dos resíduos de aminoácidos carregados presentes nos segmentos transmembrana da permease AGT1, com o intuito de entender o mecanismo de transporte e contribuir para a otimização dos processos fermentativos. Mutações sítio-dirigidas foram feitas em aminoácidos específicos da proteína e o perfil metabólico de utilização de maltotriose pela cepa portando a proteína mutada foi analisado. A atividade de transporte foi determinada utilizando um substrato específico para o transportador (pNPαG), através de ensaios de co-transporte de prótons e utilizando açúcares radioativos como substrato. Os resultados obtidos identificaram alguns resíduos importantes para a atividade de transporte do AGT1. O resíduo R-504 mostrou-se essencial para a funcionalidade da proteína: sua substituição por um resíduo neutro aboliu completamente a atividade de transporte. Mutantes nos resíduos E-120, D-123 e E-167 mostraram atividades de transporte reduzidas quando comparados a proteína normal. A mutação no resíduo E-120 afetou o transporte de açúcar e o co-transporte de H⁺, enquanto que a substituição dos resíduos D-123 e E-167 prejudicou principalmente o transporte do H⁺, desacoplando o transporte açúcar-H⁺. Para compreendermos melhor o papel destes dois resíduos (D-123 e E-167) na ligação do H⁺, construímos uma proteína portando as duas mutações combinadamente. A levedura portando esse duplo mutante foi incapaz de utilizar maltotriose e de transportar pNPαG. Portanto, quando os dois resíduos encontram-se mutados na proteína, tem-se a perda total da atividade de transporte. Então, podemos sugerir que ambos resíduos cooperam na ligação do H⁺ durante o transporte de açúcares pelo AGT1, e na presença de apenas uma das mutações na proteína, a ligação do H⁺ é estabelecida com o outro resíduo. Estes resultados serão comparados com o modelo da lactose permease de E. coli, um transportador ativo de açúcares cuja estrutura cristalina foi recentemente determinada.