ÿþ<HTML><HEAD><TITLE>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </TITLE><link rel=STYLESHEET type=text/css href=css.css></HEAD><BODY aLink=#ff0000 bgColor=#FFFFFF leftMargin=0 link=#000000 text=#000000 topMargin=0 vLink=#000000 marginheight=0 marginwidth=0><table align=center width=700 cellpadding=0 cellspacing=0><tr><td align=left bgcolor=#cccccc valign=top width=550><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=3><font size=1>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </font></font></strong><font face=Verdana size=1><b><br></b></font><font face=Verdana, Arial,Helvetica, sans-serif size=1><strong> </strong></font></font></td><td align=right bgcolor=#cccccc valign=top width=150><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=1><font size=1>ResumoID:1963-2</font></em></font></strong></font></td></tr><tr><td colspan=2><br><br><table align=center width=700><tr><td>Área: <b>Genética e Biologia Molecular ( Divisão N )</b><p align=justify><strong>DESENVOLVIMENTO DE FERRAMENTAS GENÉTICAS PARA <SPAN STYLE="FONT-STYLE: ITALIC;">AZOSPIRILLUM AMAZONENSE</SPAN> </strong></p><p align=justify><b>Fernando Hayashi Sant'anna </b> (<i>UFRGS</i>); <b>Dieime de Souza Andrade </b> (<i>UFRGS</i>); <b>Irene Silveira Schrank </b> (<i>UFRGS</i>)<br><br></p><b><font size=2>Resumo</font></b><p align=justify class=tres><font size=2> O gênero <span style="font-style: italic;">Azospirillum </span>é reconhecido por compreender espécies bacterianas que promovem o crescimento de vegetais de importância econômica pela produção de fitormônios e pela fixação biológica do nitrogênio. A bactéria <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span> possui particularidades em relação a outras espécies do gênero, como a competência de fixar nitrogênio na presença de amônia e a incapacidade de desnitrificar. Ambas caracterísiticas conferem a <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span> potencial para ser utilizada como biofertilizante. Entretanto, muito pouco se conhece sobre sua genética, bem como sua fisiologia. Portanto, o desenvolvimento de ferramentas que permitam a&nbsp; manipulação genética dessa bactéria se tornam relevantes.&nbsp; O presente trabalho visa estabelecer metodologias de transferência de DNA para <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span>, bem como desenvolver vetores para investigação de promotores através de genes-repórteres e vetores para mutagênese sítio-dirigida. <br>Duas metodologias de transferência gênica foram empregadas: eletrotransformação e conjugação triparental. Para isso, utilizou-se vetores com origens de replicação de amplo espectro pBBR1 e pVS1, com marca de seleção para canamicina. Na análise dos promotores será utilizado como gene-repórter o gene que codifica EYFP (enhanced yellow fluorescent protein). O vetor suicida pSUP202 será utilizado para mediar a mutagênese sítio dirigida dos genes <span style="font-style: italic;">glnB </span>e <span style="font-style: italic;">glnK </span>(envolvidos no metabolismo do nitrogênio).<br>Inicialmente, o método de transferência de DNA empregado foi o de eletroporação, entretanto, até o momento, não foram obtidos resultados positivos. O método de conjugação triparental foi utilizado e teve resultados satisfatórios. Os vetores mobilizáveis pHRGUSGFP (pBBR1) e pPZPLACEYFP (pVS1), que expressam proteínas fluorescentes,&nbsp; foram eficientemente transferidos para <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span>. Os transconjugantes apresentaram fluorescência, confirmando o sucesso da metodologia. Foram construídos vetores derivados do plasmídeo pPZPLACEYFP contendo o gene <span style="font-style: italic;">eyfp </span>governado pelos promotores dos genes <span style="font-style: italic;">glnB </span>e <span style="font-style: italic;">glnK</span>, respectivamente. Entretanto, não se obteve transconjugantes estáveis à partir dessas construções. A tentativa de mutagênese sítio-dirigida foi realizada com o vetor pSUPKK-GEN, derivado do vetor suicida pSUP202 que contém o gene glnk interrompido por um cassete de resistência ao antibiótico canamicina. Por enquanto, foram obtidos&nbsp; somente mutantes oriundos de eventos de recombinação simples, pois integraram o vetor ao genoma sem substituírem o gene selvagem. <br>O método de conjugação com vetores com origens de replicação pVS1 e pBBR1 se mostrou adequado como metodologia de transferência de DNA&nbsp; para <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span>.&nbsp; Para análise de promotores serão construídos plasmídeos&nbsp; com origem de replicação pBBR1, já que derivados de pPZPLACEYFP não foram estáveis. Plasmídeos derivados de pSUP202 são boas alternativas para metodologias que necessitem a integração de DNA no genoma de <span style="font-style: italic;">A. amazonense</span>.<br><br> </font></p><br><b>Palavras-chave: </b>&nbsp;Azospirillum, transformação, conjugação, gfp, mutagênese</td></tr></table></tr></td></table></body></html>