ÿþ<HTML><HEAD><TITLE>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </TITLE><link rel=STYLESHEET type=text/css href=css.css></HEAD><BODY aLink=#ff0000 bgColor=#FFFFFF leftMargin=0 link=#000000 text=#000000 topMargin=0 vLink=#000000 marginheight=0 marginwidth=0><table align=center width=700 cellpadding=0 cellspacing=0><tr><td align=left bgcolor=#cccccc valign=top width=550><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=3><font size=1>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </font></font></strong><font face=Verdana size=1><b><br></b></font><font face=Verdana, Arial,Helvetica, sans-serif size=1><strong> </strong></font></font></td><td align=right bgcolor=#cccccc valign=top width=150><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=1><font size=1>ResumoID:1764-1</font></em></font></strong></font></td></tr><tr><td colspan=2><br><br><table align=center width=700><tr><td>Área: <b>Imunologia Clínica e Diagnóstico ( Divisão F )</b><p align=justify><strong>ESTRATÉGIA DE CLONAGEM DO FRAGMENTO VARIÁVEL DE CADEIA ÚNICA (SCFV) DO ANTICORPO ANTI-INTIMINA</strong></p><p align=justify><b><u>Márcio Anunciação Menezes </u></b> (<i>IBu</i>); <b>Karina Araujo Aires </b> (<i>IBu</i>); <b>Renato de Mello Ruiz </b> (<i>IBu</i>); <b>Christiane Yumi Ozaki </b> (<i>IBu</i>); <b>Waldir Pereira Elias Junior </b> (<i>IBu</i>); <b>Roxane Maria Fontes Piazza </b> (<i>IBu</i>)<br><br></p><b><font size=2>Resumo</font></b><p align=justify class=tres><font size=2><P class=MsoNormal style="MARGIN: 0cm 0cm 0pt; LINE-HEIGHT: normal; TEXT-ALIGN: justify"><B><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'">Introdução:</SPAN></B><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold"> A adesão de <I style="mso-bidi-font-style: normal">E. coli</I> enteropatogênica (EPEC) e enterohemorrágica (EHEC) ao enterócito é mediada pela intimina, uma proteína de membrana externa de 94 kDa que contém uma região conservada N-terminal </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold; mso-fareast-font-family: 'Arial Unicode MS'">imunogênica, portanto um excelente alvo para diagnóstico.</SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold"> </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-family: 'Segoe UI'; mso-fareast-font-family: 'Segoe UI'">Embora tenha apresentado boa especificidade </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold">no <I style="mso-bidi-font-style: normal">immunoblotting</I>, o anticorpo monoclonal IgG2b anti-intimina falhou em detectar alguns isolados de EPEC. Além disso, a obtenção de anticorpos a partir de hibridomas tem alto custo. Um modelo alternativo de produção de anticorpos é a geração do </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold; mso-fareast-font-family: 'Arial Unicode MS'">fragmento variável de cadeia única (scFv) em sistemas de expressão heterólogos. <B>Objetivo:</B> Clonagem de scFv anti-intimina em uma estratégia de amplificação utilizando iniciadores específicos para unir as cadeias da fração variável. <B>Metodologia:</B> O mRNA foi extraído de hibridomas IgG2b anti-intimina e reversamente transcrito para cDNA. As cadeias leve (CL) e pesada (CP) da fração variável foram amplificadas por PCR utilizando um kit comercial. Foi utilizada uma estratégia de clonagem de scFv em 4 etapas. 1<SUP>a</SUP>: quatro iniciadores foram desenhados para amplificar CP e CL, sendo que os iniciadores reverso da CP e <I>forward</I> da CL apresentavam regiões complementares ao <I style="mso-bidi-font-style: normal">linker</I> (fragmento de DNA que liga a CP à CL), e os iniciadores <I>forward </I>da CP e reverso da CL continham os sítios <I>BamHI</I> e <I>HindIII</I>, respectivamente. 2<SUP>a</SUP>: a CL foi re-amplificada utilizando o <I>linker </I>como iniciador <I>forward </I>(gerando o produto <I>Linker-</I>CL).<I> </I>3<SUP>a</SUP>: a CP e o <I>Linker</I>-CL foram unidos por PCR por complementariedade das porções 3' da CP e 5' do <I>Linker</I>-CL, e utilizando os iniciadores CP <I>forward</I> e CL reverso. O scFv obtido foi clonado em vetor de expressão pAE digerido com <I style="mso-bidi-font-style: normal">BamHI</I> e <I style="mso-bidi-font-style: normal">HindIII</I>. <B>Resultados:</B> </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold">Utilizando os iniciadores sintetizados</SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold; mso-fareast-font-family: 'Arial Unicode MS'">, as CP e CL foram amplificadas, resultando em uma banda de 330 pb cada. A ligação por PCR de CP e <I>Linker</I>-CL gerou um fragmento de 720 pb, correspondente ao esperado para o scFv. <B>Discussão: </B>O processo de clonagem de scFv exigiu estratégias no desenho dos iniciadores e na abordagem de amplificação, uma vez que a primeira amplificação das cadeias foi realizada utilizando iniciadores aleatórios de um kit, gerando um <I>stop codon</I> prematuro em scFv. Os iniciadores específicos permitiram a correta clonagem de scFv. Esta técnica permitirá a expressão em larga escala de anticorpos com baixo custo para o diagnóstico de </SPAN><SPAN style="FONT-SIZE: 12pt; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-bidi-font-weight: bold">EPEC e EHEC.<?xml:namespace prefix = o ns = "urn:schemas-microsoft-com:office:office" /><o:p></o:p></SPAN></P><B style="mso-bidi-font-weight: normal"><SPAN style="FONT-SIZE: 10pt; LINE-HEIGHT: 115%; FONT-FAMILY: 'Arial','sans-serif'; mso-fareast-language: AR-SA; mso-fareast-font-family: Calibri; mso-ansi-language: PT-BR; mso-bidi-language: AR-SA">Apoio: FAPESP</SPAN></B></font></p><br><b>Palavras-chave: </b>&nbsp;EPEC, EHEC, intimina, anticorpo recombinante, scFv</td></tr></table></tr></td></table></body></html>