| Área: Fermentação e Biotecnologia ( Divisão J ) CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA ALFA-AMILASE EM LINHAGEM LABORATORIAL DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE ATRAVÉS DO SISTEMA "DELTA-INTEGRAÇÃO" Fábio Silva de Carvalho (USP); Keina Poliana Pivarro Dalmolin (USP); Ana Raquel de Souza Monteiro (USP); Elisabete José Vicente (USP)
ResumoO Brasil é reconhecido mundialmente pela produção do etanol combustível, sendo seu principal substrato a cana-de-açúcar. Estudos recentes apontam a mandioca como uma das melhores fontes renováveis para a produção de etanol, por consumir menos energia no processo agroindustrial e possuir um sistema de cultivo mais sustentável, quando comparada à cana ou ao milho (Salla, 2008). Saccharomyces cerevisiae é reconhecidamente o organismo mais utilizado no processo industrial de fermentação, porém esta levedura não possui a capacidade de hidrolisar moléculas de amido. Visando a obtenção de clones recombinantes com esta capacidade, genes codificadores de enzimas amilolíticas vêm sendo clonados nesta levedura. 㰀倀㸀伀 漀樀攀琀椀瘀漀 搀攀猀琀攀 琀爀愀戀愀氀栀漀 昀漀椀 挀氀漀渀愀爀 攀 攀砀瀀爀攀猀猀愀爀 漀 挀愀猀猀攀琀攀 搀攀 攀砀瀀爀攀猀猀漀 搀漀 最攀渀攀 搀愀 㰀䘀伀一吀 昀愀挀攀㴀匀礀洀戀漀氀㸀愀㰀⼀䘀伀一吀㸀㰀䘀伀一吀 昀愀挀攀㴀∀吀椀洀攀猀 一攀眀 刀漀洀愀渀Ⰰ 吀椀洀攀猀Ⰰ 猀攀爀椀昀∀㸀ⴀ愀洀椀氀愀猀攀 搀攀 㰀䔀䴀㸀䈀⸀ 猀甀戀琀椀氀椀猀㰀⼀䔀䴀㸀 攀洀 㰀䔀䴀㸀匀⸀ 挀攀爀攀瘀椀猀椀愀攀㰀⼀䔀䴀㸀Ⰰ 攀洀瀀爀攀最愀渀搀漀 漀 猀椀猀琀攀洀愀 搀攀氀琀愀ⴀ椀渀琀攀最爀愀漀 ⠀䜀攀爀爀愀 攀琀 愀氀⸀Ⰰ ㈀ 㔀⤀⸀㰀⼀䘀伀一吀㸀㰀⼀倀㸀
O cassete de expressão da a-amilase com o promotor constitutivo do gene da álcool-desidrogenase ADH1 foi isolado do plasmídeo pAA3 (Moraes, 1995), empregando-se a endonuclease BamHI e, em seguida, inserido no vetor pGEMT-Easyd, responsável pelo sistema delta-integração. Esta estratégia permitiu a inserção de múltiplas cópias do cassete de expressão no genoma da levedura, que foram integradas por homologia nos sítios do elemento (d) do transposon Ty1. Para a confirmação da integração, os transformantes foram semeados em meio sólido YPDA (0,5% de amido) e foi observada a formação de halos de amilolise quando as colônias foram submetidas ao vapor de iodo. 㰀倀㸀䘀漀爀愀洀 椀猀漀氀愀搀漀猀 椀渀切洀攀爀漀猀 挀氀漀渀攀猀 爀攀挀漀洀戀椀渀愀渀琀攀猀Ⰰ 搀攀猀猀攀猀 㐀 昀漀爀愀洀 愀渀愀氀椀猀愀搀漀猀 焀甀愀渀琀漀 搀攀最爀愀搀愀漀 搀漀 愀洀椀搀漀 渀漀 洀攀椀漀Ⰰ 猀攀渀搀漀 攀渀挀漀渀琀爀愀搀漀 甀洀 挀氀漀渀攀 焀甀攀 攀砀瀀爀攀猀猀愀 漀 最攀渀攀 搀愀 㰀䘀伀一吀 昀愀挀攀㴀匀礀洀戀漀氀㸀愀㰀⼀䘀伀一吀㸀㰀䘀伀一吀 昀愀挀攀㴀∀吀椀洀攀猀 一攀眀 刀漀洀愀渀Ⰰ 吀椀洀攀猀Ⰰ 猀攀爀椀昀∀㸀ⴀ愀洀椀氀愀猀攀⸀ 䄀猀猀椀洀 攀猀琀愀 洀愀椀猀 甀洀愀 最爀愀渀搀攀 昀攀爀爀愀洀攀渀琀愀 焀甀攀 瀀漀搀攀爀 猀攀爀 攀洀瀀爀攀最愀搀愀 瀀愀爀愀 愀 漀琀椀洀椀稀愀漀 搀漀 瀀爀漀挀攀猀猀漀 搀攀 瀀爀漀搀甀漀 搀漀 攀琀愀渀漀氀☀渀戀猀瀀㬀愀 瀀愀爀琀椀爀 搀攀 猀甀戀猀琀爀愀琀漀猀 愀洀椀氀挀攀漀猀⸀㰀⼀䘀伀一吀㸀㰀⼀倀㸀㰀⼀昀漀渀琀㸀㰀⼀瀀㸀㰀戀爀㸀㰀戀㸀倀愀氀愀瘀爀愀猀ⴀ挀栀愀瘀攀㨀 㰀⼀戀㸀☀渀戀猀瀀㬀攀琀愀渀漀氀Ⰰ 昀攀爀洀攀渀琀愀漀 搀攀 愀洀椀搀漀Ⰰ 搀攀氀琀愀ⴀ椀渀琀攀最爀愀漀Ⰰ 匀愀挀挀栀愀爀漀洀礀挀攀猀 挀攀爀攀瘀椀猀椀愀攀㰀⼀琀搀㸀㰀⼀琀爀㸀㰀⼀琀愀戀氀攀㸀㰀⼀琀爀㸀㰀⼀琀搀㸀㰀⼀琀愀戀氀攀㸀㰀⼀戀漀搀礀㸀㰀⼀栀琀洀氀㸀
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