CARACTERIZAÇÃO DO GENE PHAC DE BURKHOLDERIA SACCHARI RESPONSÁVEL PELA PRODUÇÃO DE POLIHIDROXIALCANOATOS (PHA).

Yeimy Paola Galindo Rozo (USP); Erica Mendes Pereira (USP); Luiziana Ferreira da Silva (USP); Jose Gregório Cabrera Gomez (USP)

Burkholderia sacchari é uma nova espécie bacteriana isolada de solo brasileiro que cresce em sacarose, acumulando grânulos intracelulares de homopolímero poli-3-hidroxibutirato (P3HB), quando há excesso de fonte de carbono disponível e limitação de pelo menos um nutriente essencial para a multiplicação celular. A produção de PHA depende da natureza química da matéria-prima fornecida como fonte de carbono, assim como das vias metabólicas que a bactéria produtora possui. A polihidroxialcanoato sintase ( codificada pelo gene phaC) é a enzima chave envolvida na síntese bacteriana do poliéster biodegradável e biocompatível pertencente à família dos PHA, uma vez que sua especificidade pelo substrato define a natureza do polímero final. De acordo com a estrutura primária das seqüências dos genes codificadores e da especificidade das PHA sintases pelo substrato, estas foram recentemente divididas em quatro classes, as quais apresentam unidades características, espécies microbianas típicas e substrato preferencial. O amplicon completo do gene da PHA sintase (phaC) de B. sacchari foi amplificado utilizando técnicas de PCR (reação da polimerase em cadeia) e primers degenerados, construídos com base em seqüências de genomas de Burkholderia disponíveis na literatura. Foi obtido um amplicon do tamanho esperado (2,0Kb). Este amplicon do gene phaC  foi clonado no vetor pGEM-T Easy, seqüenciado e submetido à análise, utilizando a ferramenta disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTx e comparado com outras espécies de Burkholderia, apresentando 80-90% de similaridade com outros genes phaC. Testes de complementação fenotípica foram realizados, indicando que o gene phaC_Bs foi capaz de restituir o fenótipo PHB⁺ em mutantes de B. sacchari e Ralstonia eutropha  incapazes de acumular PHB (PHB^-). A capacidade de restituição do fenótipo foi avaliada por métodos de detecção baseados em corantes lipofílicos (Sudan black B e Nile red) assim como por ensaios de acúmulo em frascos agitados.