ÿþ<HTML><HEAD><TITLE>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </TITLE><link rel=STYLESHEET type=text/css href=css.css></HEAD><BODY aLink=#ff0000 bgColor=#FFFFFF leftMargin=0 link=#000000 text=#000000 topMargin=0 vLink=#000000 marginheight=0 marginwidth=0><table align=center width=700 cellpadding=0 cellspacing=0><tr><td align=left bgcolor=#cccccc valign=top width=550><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=3><font size=1>25º Congresso Brasileiro de Microbiologia </font></font></strong><font face=Verdana size=1><b><br></b></font><font face=Verdana, Arial,Helvetica, sans-serif size=1><strong> </strong></font></font></td><td align=right bgcolor=#cccccc valign=top width=150><font face=arial size=2><strong><font face=Verdana, Arial, Helvetica, sans-serif size=1><font size=1>ResumoID:1279-1</font></em></font></strong></font></td></tr><tr><td colspan=2><br><br><table align=center width=700><tr><td>Área: <b>Microbiologia de Alimentos ( Divisão K )</b><p align=justify><strong>DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO PARA A QUANTIFICAÇÃO DIRETA DE <SPAN STYLE="FONT-STYLE: ITALIC;">SALMONELLA</SPAN> SP. POR TRANSCRIPTASE REVERSA-PCR-TEMPO REAL </strong></p><p align=justify><b>Hans Fröder </b> (<i>FCF/USP</i>); <b>Mariza Landgraf </b> (<i>FCF/USP</i>); <b>Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco </b> (<i>FCF/USP</i>); <b>Burkhard Malorny </b> (<i>BfR</i>); <b>Maria Teresa Destro </b> (<i>FCF/USP</i>)<br><br></p><b><font size=2>Resumo</font></b><p align=justify class=tres><font size=2> <meta http-equiv="CONTENT-TYPE" content="text/html; charset=utf-8"><title>Desenvolvimento de métodos para a quantificação direta de Salmo</title><meta name="GENERATOR" content="OpenOffice.org 2.2 (Linux)"><meta name="AUTHOR" content="PASCHOAL"><meta name="CREATED" content="20090810;9350000"><meta name="CHANGEDBY" content="Hans"><meta name="CHANGED" content="20090810;13490000"> <style type="text/css"> <!-- @page { margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } --> </style> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">1. Introdução</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">Para obter resultados rápidos e confiáveis que permitam o monitoramento da segurança microbiológica de alimentos, quer seja pela indústria ou pelos órgãos de fiscalização, diversos métodos alternativos têm sido desenvolvidos para a detecção e quantificação de </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">. Métodos que empregam a PCR-tempo real (PCR-RT) vem ganhando aprovação para detecção de patógenos, inclusive os de origem alimentar. </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">A transcriptase reversa-PCR (RT-PCR) tem sido empregada em conjunto com PCR-RT, permitindo a detecção e a quantificação de mRNA de uma única célula. </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">O propósito do estudo foi desenvolver um ensaio para quantificar </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> baseado na transcriptase reversa-PCR-tempo real (RT-PCR-RT).</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">2. Material e Métodos</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">Caldos de carne suína e de ave foram preparados, coletados em tubos estéreis e foram denominados alimento-modelo suíno e alimento-modelo ave. Alíquotas desses alimentos-modelo foram artificialmente contaminadas com população elevada (&#8776; 6 log UFC/mL) e baixa (&#8776; 2 log UFC/mL) de </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> Typhimurium DT 104, mantidas a 20 °C e a 8 °C e submetidas à quantificação do patógeno em diferentes tempos pós-inoculação. Após estabilização celular, extração e purificação, o RNA total isolado foi quantificado por RT-PCR-RT utilizando como alvo o gene </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>tuf</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> num ensaio </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">-específico desenvolvido nesse estudo. Como controle empregou-se a enumeração de </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> por técnicas convencionais. </font></font> </p> <p class="western" style="text-indent: 1.25cm; margin-bottom: 0cm;" align="justify"> <br> </p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">3. Resultados e Discussão</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> </font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">A quantificação de </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>Salmonella</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> por RT-PCR-RT apresentou limite de detecção de 2 log UFC</font></font><sub><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">eq</font></font></sub><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> e eficiência de amplificação de 100%. Não houve diferença significativa </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">entre os resultados obtidos pelo método convencional e o molecular (p&#8805;0,05) tanto para</font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> p</font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">opulação elevada como para baixa em ambos os alimentos-modelo</font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i> </i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">mantidos a 20 °C e para os alimentos-modelo mantidos a 8</font></font><sup><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">o</font></font></sup><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">C e com população baixa. Por outro lado, houve diferença significativa (p&lt;0,05) para população elevada nas amostras mantidas a 8° C. Observou-se também que alimentos-modelo mantidos a 20 °C apresentaram uma queda mais rápida na expressão de </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>tuf </i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">do que aqueles mantidos a 8 °C.</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">4. Conclusão</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;" align="justify"><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">O método RT-PCR-RT empregando </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>tuf</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> apresenta potencial para uso, mas ainda precisa ser submetido a novas avaliações e aprimoramento, a fim de buscar melhoria no limite de detec</font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">ção. </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">Também é importante que seja avaliada a meia-vida do </font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"><i>tuf</i></font></font><font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">-RNA, para que se possa quantificar somente RNA de células viáveis. A desvantagem deste método é a conversão de RNA para cDNA, que pode contribuir para as variações e a falta de reprodutibilidade devido ao estado dinâmico das células, a qualidade variável do RNA purificado e a disponibilidade do molde para a conversão. </font></font> </p> <p class="western" style="text-indent: -0.03cm; margin-bottom: 0cm;" align="justify"> <font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2">5. Agradecimentos</font></font></p> <p class="western" style="text-indent: -0.03cm; margin-bottom: 0cm;" align="justify"> <font face="Arial, sans-serif"><font style="font-size: 11pt;" size="2"> CAPES, CNPq e DAAD.</font></font></p> <p class="western" style="margin-bottom: 0cm;"><br> </p> </font></p><br><b>Palavras-chave: </b>&nbsp;Salmonella sp., quantificação, transcriptase reversa-PCR-tempo real, tuf</td></tr></table></tr></td></table></body></html>