IDENTIFICAÇÃO DE MICOBACTÉRIAS ATRAVÉS DO SEQUENCIAMENTO DO GENE HSP 65.

Jesus Pais Ramos (CRPHF/ENSP/Fiocruz); Carlos Eduardo Dias Campos (CRPHF/ENSP/Fiocruz); Paulo Cesar de Souza Caldas (CRPHF/ENSP/Fiocruz); Luciana Distásio de Carvalho (CRPHF/ENSP/Fiocruz); Angela Maria Werneck Barreto (CRPHF/ENSP/Fiocruz)

O Laboratório. de Bacteriologia da Tuberculose do Centro de Referência Professor Hélio Fraga/ ENSP - FIOCRUZ tem um serviço rotineiro de identificação de Micobactérias a partir de caracteres fenotípicos e alguns métodos moleculares (sondas e PRA – PCR - Restriction enzyme analysis). Essas metodologias nem sempre permitem uma identificação rápida e inequívoca no nível de espécie. Propomos a análise da região hsp65 de cepas oriundas do Centro de Referência, para delinear estratégias de identificação de micobactérias e realizar levantamento molecular de espécies de micobactérias "não tuberculosas" (MNT).Cerca de 100ng de ADN de cada cepa analisada foi adicionado a um microtubo contendo 50 µl do Mix de PCR: 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl [pH 8.3], 1,5 mM MgCl2, 10% glycerol, 200 mM de cada dNTP, 25 pmol de cada iniciador Tb11 e Tb12 e 1U da Taq polimerase. Cada microtubo foi colocado em um Termociclador programado com os seguintes ciclos: 95°C por 5 min. Depois, 45 ciclos de amplificação a 94°C ,1 min. , 60°C 1 min. , 72°C, 1 min, seguida por outra a 72°C, 10 min. Os produtos de PCR foram submetidos a separação eletroforética em gel de Agarose a 2% e purificados utilizando colunas ILLustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE healtcare), segundo as condições fornecidas pelo fabricante. As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit de sequenciamento big dye terminator v3.1 (applied biosystems), seguindo as condições recomendadas pelo fabricante. Depois, as amostras foram precipitadas com isopropanol, ressuspendidas em 10 µL de formamida HI DI e submetidas à eletroforese no sequenciador 3130 (applied biosystems). Os dados fornecidos foram analisados comparando as sequências obtidas com outras existentes nos banco de dados: BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Dos 42 isolados utilizados, foi possível a identificação inequívoca de 54.14%, sendo mais da metade destes com 100% de identidade. Dente os não identificados 6 isolados mostraram níveis de identidade abaixo de 97%, quando comparadas com sequências disponíveis no BLAST.