PROPRIEDADES BIOQUÍMICAS DE UMA ALFA AMILASE DE CRYPTOCOCCUS FLAVUS EXPRESSA EM SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Muriele Taborda Lottermann (UnB); Alexsandro Sobreira Galdino (UnB); Lidia Maria Pepe de Moraes (UnB); Cirano José Ulhoa (UFG); Fernando Araripe Gonçalves Torres (UnB); Sonia Maria Freitas (UnB)

Recentemente, o desenvolvimento de novas cepas de Saccharomyces cerevisiae capazes de expressar amilases tem sido o foco de muitas pesquisas biotecnológicas, tanto na produção industrial dessas enzimas quanto na produção de etanol a partir de biomassa. Saccharomyces cerevisiae é um microrganismo bastante utilizado como hospedeiro para expressão heteróloga por possuir algumas vantagens, como a facilidade de manipulação e o fato de sua genética ser bem conhecida, inclusive tendo o seu genoma completamente seqüenciado. No presente trabalho, uma amilase de Cryptococcus flavus foi expressa em S. cerevisiae. A enzima recombinante (CFAMY) foi purificada até a homogeneidade utilizando-se colunas Q-sepharose e Sephacryl S-200. A análise por SDS-PAGE mostrou que a enzima possui uma massa molecular aparente de 66 kDa e uma única banda com atividade amilolítica no zimograma. A partir de ensaios bioquímicos, constatou-se que a enzima é fortemente inibida pelos íons Cu+2, Hg+2 and Zn+2, que o valor de Km (para amido solúvel) da enzima pura foi de 0,35 mg.ml^-1 e que a CFAMY é estável até 50°C por 1h; acima dessa temperatura, a enzima começa a desnaturar. A cromatografia em camada delgada (TLC) revelou que os principais produtos da hidrólise da CFAMY sobre os substratos: amido solúvel, amilopectina, amilose e pululana são oligossacarídeos de diversos tamanhos, o que caracteriza esta enzima como uma amilase de liquefação. Além disso, dados de Dicroísmo circular (CD) indicaram que CFAMY é estável na faixa de pH 4-8 e que a enzima recombinante possui uma estrutura com predominância de folhas beta, sendo, portanto, diferente da sua forma nativa onde a estrutura é uma barril (α/β)8. Esses resultados podem contribuir para o entendimento das diferenças, entre a espécie nativa e a recombinante, de Km’s e conseqüentemente de especificidade por substratos de amido.