25º Congresso Brasileiro de Microbiologia

DETECÇÃO DE LISTERIA MONOCYTOGENES ATRAVÉS DE WESTERN BLOT UTILIZANDO ANTICORPOS ANTI-INLA਀

Marcelo Mendonça (UFPel); Neida Lucia Conrad (UFPel); Fabricio Rochedo Conceição (UFPel); Ângela Nunes Moreira (UFPel); Andreia Saldanha de Lima (UFPel); Wladimir Padilha da Silva (UFPel); José Antonio Guimarães Aleixo (UFPel)

Listeria monocytogenes é o agente etiológico das listeriose, uma doença de origem alimentar severa que cursa com baixas taxas de morbidade, mas com altas taxas de mortalidade. Os métodos convencionais empregados para detecção desta bactéria em alimentos requerem vários dias para sua identificação final. Imunoensaios baseados em anticorpos monoclonais (MAbs) usados para a detecção rápida desta bactéria têm como vantagem a alta especificidade e rapidez. Dentre os diversos fatores de virulência de L. monocytogenes um dos mais bem caracterizados é a proteína de membrana externa internalina A (InlA), que é exclusiva desta espécie. No presente trabalho a técnica Western blot foi utilizada para demonstrar a reação específica de um anticorpo monoclonal anti-InlA com L. monocytogenes. Sete colônias típicas do gênero Listeria spp., isoladas nos ágares Oxford e Palcam, foram repicadas em 5 mL de Caldo de Enriquecimento para Listerias (LEB) e incubadas por 18h a 37^oC, para serem submetidas a técnica de Western blot, bem como foram repassadas para ágar TSA-YE, visando posterior confirmação bioquímica. Para o Western blot, as bactérias foram recuperadas por centrifugação, lavadas três vezes com PBS 1X, e ao final ressupendidas em 1mL de PBS 1X. Todos os cultivos foram ajustados para a mesma concentração (DO₆₀₀ 1,5) e 1mL desta concentração foi centrifugado, ressuspenso em 80µL de PBS 1X e sonicado por 3 vezes de 10 seg. Após, acrescido de 20% de tampão 5X SDS-PAGE com beta-mercaptoetanol e fervido por 10min. As amostras foram submetidas à eletroforose em gel de poliacrilamida a 10% e eletrotransferidas para a membrana de nitrocelulose. Após bloqueio com 5% de leite em pó, o MAb anti-InlA (1:500) foi adicionado à membrana durante 1h e, após lavagem, o conjugado cabra anti-camundongo com peroxidase foi adicionado e a membrana foi incubada por mais 1h. A reação foi revelada através da solução cromógena DAB. Entre as sete colônias, quatro apresentaram banda de massa molecular para a proteína InlA de L. monocytogenes, o que foi posteriormente confirmado por bioquimismo. O tempo total de confirmação utilizando a técnica de Western blot após as colônias serem selecionadas foi de aproximadamente 30h. O Western blot utilizando MAb anti-InlA produzidos in house demonstrou-se específico, podendo ser aplicado na rápida detecção de L. monocytogenes.