| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 1500-1 | ||||
Resumo:Entre os medicamentos usados no tratamento quimioterapêutico da leucemia linfoblástica aguda (LLA), está incluída a L-asparaginase (ASNase). Esta enzima possui propriedades antitumorais devido à sua capacidade hidrolítica e tem contribuído com sucesso para o tratamento da LLA. Esta enzima tem um forte potencial imunogénico com uma ampla gama de reações adversas, uma vez que a variante comercial é de origem bacteriana. Portanto, encontrar novas variantes com atividade e menor imunogenicidade é uma prioridade máxima para a ciência. Uma das abordagens usadas para abordar este problema é o design de enzimas quiméricas, que pode ser uma solução promissora. Este estudo concentra-se na obtenção de uma variante humanizada recombinante da asparaginase e na otimização da sua expressão no periplasma de Escherichia coli (E. coli).
A amplificação do gene sintético para a ASNase quimérica foi realizada através da PCR. Foram usados primers específicos, que incluíram a adição de uma sequência de histidina na extremidade N-terminal para fins de purificação, bem como uma sequência sinal para permitir a expressão periplasmática da enzima quimérica. Posteriormente, os amplicons foram purificados usando um kit de extração de gel (Qiagen) e introduzidos no vetor de expressão pET-22b(+) (Novagen) através da digestão enzimática de ambos usando NcoI e XhoI, seguida de ligação usando a ligase de DNA T4. Os plasmídeos recombinantes resultantes foram introduzidos nas células E. coli DH5α através da eletroporação. Células resistentes foram selecionadas por cultura em meio contendo ampicilina (100 μg/ml) e sobrexpressas nas cepas E. coli BL21(DE3) e Rosetta (DE3). O crescimento foi realizado em meio LB com antibióticos por 3 horas a 37°C e 200 rpm. A expressão da proteína foi induzida usando IPTG. Após a indução, as células foram centrifugadas, e o pellet resultante foi incubado em um tampão de lise (Bug Buster) na proporção de 1 g de células para 5 ml de tampão, com a adição de inibidores de protease. A enzima periplasmática foi então extraída. Posteriormente, foi realizada uma centrifugação a 16.000 rpm por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante obtido foi avaliado usando SDS-PAGE a 14%. A atividade enzimática foi avaliada qualitativamente usando o método de hidroxilamina e quantitativamente usando o método de Nessler. Para otimizar a indução da expressão da proteína quimérica por IPTG, foi criado um gráfico de superfície de resposta usando o Software Matemático Design Expert. Isso envolveu a avaliação de 5 condições de temperatura, 6 concentrações de IPTG e 5 tempos diferentes em culturas com um volume total de 50 ml. Os resultados obtidos demonstraram que a enzima quimérica humanizada projetada pode ser expressa e até apresenta atividade de asparaginase. Observou-se que a cepa Rosetta é favorável para a expressão de proteínas humanizadas em bactérias em comparação com a BL21. Também foi comprovado que a cauda de histidina introduzida durante o processo de clonagem não afetou a atividade da enzima, que mostrou uma atividade de 2,4 U/mL no extrato bruto. Após a otimização, foi constatado que, sob condições mínimas de tempo (2 h) e concentração mínima de IPTG (0,01 mM) com temperatura máxima (37°C), é alcançada a máxima atividade. Este ponto foi validado e correspondeu de perto ao resultado do design da superfície de resposta. Isso representa um avanço significativo no tratamento da LLA.
Palavras-chave: Asparaginase, plasmídeos, quimérica, Rosetta, otimização. Agência de fomento:FAPESP-UFRO 2020/06982-3, Agencia Nacional De Investigación y Desarrollo, Chile (ANID) | |||||