| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 1206-1 | ||||
Resumo:É inteligível que o uso de plásticos fósseis de origem sintética (POS), em específico o polietileno tereftalato (PET), são intrínsecos ao consumo da sociedade. Produtos feitos de PET podem causar diversos malefícios a humanidade por seu breve uso, causando acúmulo alarmante por seu tempo de biodegradação extremamente vagaroso, fator que gera grande impacto ambiental. A descoberta de microrganismos capazes de potencializar essa degradação, como a bactéria Ideonella sakaiensis, capaz de usar o PET como fonte de carbono por meio da produção de duas enzimas, PETase e a MHETase, trouxe perspectivas quanto à viabilidade da degradação e reutilização de POS. Assim, realizamos a prospecção de genes ortólogos ao da I. sakaiensis em bancos de dados públicos, e foi encontrado uma sequência codificante de carboximetilenobunenolidase (CMBase), de Hidrogenobacter thermophilus (HtCMBase). Ademais, realizou-se a transformação, a expressão, a purificação, além da caracterização bioquímica e estrutural da enzima. Os estudos bioquímicos revelaram que a HtCMBase apresenta atividade esterásica em mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT) e bis-1,2-hidroxietil tereftalato, apresentando um mecanismo de ação similar a MHETase de I. sakaiensis, que hidrolisa a ligação éster do mono-(2-hidroxietil) tereftalato (MHET) formando ácido tereftálico e etileno glicol. A análise do modelo tridimensional da HtCMBase revelou divergências de seu sítio ativo. Foi descoberto que a CMBase apresenta a tríade catalítica composta por Cis-Asp-His, ao invés do sítio catalítico conservado com a presença de serina-ácido e aspártico-histidina, encontrado em outras enzimas que degradam PET. A tríade catalítica Cis-Asp-His da HtCMBase apresenta uma combinação de resíduos da tríade catalítica das tiol proteases, que contêm resíduos de cisteína, asparagina e histidina, e das serina proteases, que possuem serina, aspartato e histidina e em seus sítios ativos. Essa descoberta proporcionou oportunidade para aprofundarmos os estudos, sobre as características funcionais das dienolactona hidrolases em aplicações inéditas dessa classe de enzimas, relacionada à hidrólise de ésteres de tereftalato. Nesse sentido foi realizada a mutação no sítio ativo da HtCMBase, através da troca de uma cisteína por uma serina (HtCMBaseC121S). Para a realização dessa mutação, foram produzidos primers por meio da ferramenta NEBase Changer. A mutação foi realizada com o kit KLD Enzyme Mix (New England). Seus sítios ativos alterados foram confirmados por eletroforese de DNA e por sequenciamento Sanger. Com o gene já no vetor pET-28 a (+), o DNA plasmidial foi transformado em BL21 para expressão heteróloga das proteínas de interesse. Após a indução da expressão das proteínas com Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosida (IPTG), as células foram lisadas em equipamento sonicador, seguido de purificação por cromatografia de afinidade. A análise da purificação foi feita em gel SDS-PAGE e a atividade das proteínas foi analisada frente a substratos ésteres. Os estudos visando avaliar diferenças na atividade catalíticas e especificidade com diferentes substratos da HtCMBaseC121S estão em andamento. A compreensão das semelhanças e diferenças entre enzimas ativas em PET, pode contribuir a melhor compreensão dos mecanismos de ação dessas enzimas, bem como apresentam potencial ao desenvolvimento de aplicações práticas relacionadas a reciclagem de plásticos, através de engenharia de proteínas com atividades catalíticas superiores. Palavras-chave: Biotecnologia, Biodegradação de PET, MHETase, PETase Agência de fomento:Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) | |||||