| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 996-1 | ||||
Resumo:Lacases são enzimas que atuam oxidando substratos orgânicos, incluindo uma variedade de compostos fenólicos e aromáticos. Lacases fúngicas, são ótimas opções para biorremediações como a descoloração de corantes têxteis e tratamento de efluentes contaminados com micropuluentes como fármacos e corantes, bem como no tratamento de resíduos lignocelulósicos. O fungo Lentinus berteroi é um basidiomiceto que apresenta distribuição neotropical, sendo regularmente consumidos como alimento por indígenas. Destaca-se a sua capacidade de produzir enzimas de interesse biotecnológico como as ligninases, em especial a lacase. O objetivo deste trabalho foi cultivar o fungo L. berteroi U21-2 da micoteca da Universidade Paranaense, para produzir, purificar e caracterizar sua lacase. O fungo foi cultivado em meio líquido contendo 20 g L-1 de glicose e 0,7 g L-1 de extrato de levedura como fonte de carbono e nitrogênio, respectivamente, e mantido por 15 dias a 28 ºC em BOD no escuro. Ao final deste período, a atividade da lacase foi verificada pela oxidação de solução de ABTS. O extrato enzimático foi filtrado em coluna Sephadex G-25 para remoção de metabólitos secundários. A fração com proteínas chamada de stripped foi concentrada em sistema Amicon de 30 kDa e as proteínas separadas por cromatografia de troca aniônica em coluna HiTrapTM Q HP no sistema Akta Prime. As frações com atividade de lacase foram coletadas, concentradas, e purificadas por cromatografia de filtração em gel, em coluna SuperdexTM Increase 200 10/300 GL em sistema Akta Pure-M. A fração purificada foi novamente concentrada para utilização nos ensaios. A última etapa da purificação também foi utilizada para estimar a massa molecular da estrutura nativa da enzima, e a pureza verificada por SDS-PAGE 12%. Os ensaios de atividade para determinação do pH e temperaturas ótimos, bem como atividade residual, foram realizados em espectrofotômetro UV-Vis, com tampão Britton-Robinson, tendo como substratos o ABTS, Guaiacol ou Siringaldazina. Dentre os principais resultados, o extrato bruto do cultivo de L. berteroi apresentou 1519 U mg -1 de atividade específica de lacase. Após as etapas de purificação a atividade específica foi de 5344 U mg -1, resultando em fator de purificação de 3,2. A massa molecular estimada para a lacase em coluna de filtração em gel foi de 79,7 kDa, formada por duas cadeias com aproximadamente 41 e 35 kDa. A enzima purificada apresentou maior atividade em pH 4,5 e temperatura de 30 °C, mostrando atividade residual de 80% nestas condições após 58 horas. O KM determinado para o ABTS, guaiacol e siringaldazina nas condições ótimas foram respectivamente: 26,5 µM, 1,8 mM e 22 µM, sendo que o guaiacol apresentou cooperatividade na reação. A massa molecular da lacase de L. berteroi, bem como o pH e temperatura ideal diferem da lacase de outros fungos do mesmo gênero. Concluímos que L. berteroi produz lacase em grande quantidade, a qual é estável a temperaturas de até 60 ºC, podendo ser utilizadas em processos de biorremediação. Palavras-chave: biorremediação, podridão branca da madeira, atividade enzimática Agência de fomento:CNPq, Capes, Fundação Araucária | |||||