| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 871-1 | ||||
Resumo:A ameaça iminente de mudanças climáticas irreversíveis tem fomentado pesquisas visando o desenvolvimento de métodos de bioprodução sustentáveis com pegadas de carbono reduzidas em relação aos métodos extrativistas atualmente usados. A utilização de gases de um carbono como substrato para bioprodução de compostos por microrganismos tem alto potencial para se tornar uma rota economicamente viável e de baixo impacto ambiental. Dentro do espectro de microrganismos com essa capacidade, a Cupriavidus necator que é capaz de utilizar CO2 como fonte de carbono juntamente com H2 como fonte de energia tem ganhado destaque como possível chassis para produção mais sustentável de bioprodutos de interesse industrial. O segmento industrial da produção de corantes tem buscado essas alternativas na tentativa de substituir os métodos químicos poluentes comumente utilizados. Alguns corantes produzidos biologicamente já são comercializados, porém para a cor azul ainda não existe substituto comercial ao composto químico índigo. Uma possível alternativa que tem sido estudada é o peptídeo não-ribossomal indigoidina, que é produzido pela enzima ingidoidina sintetase. Tendo em vista a necessidade do estudo de possíveis alternativas de produção, este trabalho visou a construção de um plasmídeo otimizado para C. necator contendo os genes responsáveis pela produção heteróloga de indigoidina induzida por L-arabinose. O plasmídeo final consiste dos genes: bpsA que codifica a enzima indigoidina sintetase, o gene sfp responsável pela codificação da enzima 4-fosfopanteteinil transferase que ativa a indigoidina sintetase, uma origem de replicação otimizada para C. necator, o gene araC para a produção do operador da arabinose, o gene kanR para seleção de cepas transformadas, e os promotores da arabinose (pBAD) que irão controlar a expressão do bpsA e sfp. O plasmídeo foi construído utilizando o protocolo Golden Gate de clonagem que utiliza a enzima Bsal para digerir e liberar extremidades coesivas específicas para cada fragmento. A fidelidade de ligação para todas as extremidades desenhadas foi calculada na ferramenta NEBridge Ligase Fidelity Viewer™ (https://ligasefidelity.neb.com) sendo predita fidelidade de 100% para todas elas. A clonagem foi realizada em duas partes a fim de facilitar a ligação dos fragmentos. Os fragmentos pCAT-araC-pBAD foram ligados separadamente dos fragmentos sfp-pBAD-bpsA. Após a ligação, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose a fim de selecionar fragmentos de tamanho correto e purificá-los do gel utilizando o kit comercial. Com os fragmentos purificados, uma nova rodada de digestão e ligação foi realizada a fim de construir o plasmídeo final com o tamanho de 8879 pb. A ligação final foi transformada em cepas de E. coli TOP10 quimiocompetentes que foram plaqueadas em LB ágar contendo L-arabinose 1% e canamicina 50 ug/ml para seleção de colônias transformadas. Da placa foram selecionadas 11 colônias isoladas para cultivo em tubo contendo 5 ml de meio LB com adição do antibiótico canamicina 50 ug/ml e, após o fim do cultivo, os plasmídeos foram extraídos e purificados utilizando o kit comercial de Mini-Prep. Para confirmar se a ligação foi bem-sucedida, foi utilizada a enzima de restrição Xbal a fim de linearizar o plasmídeo e averiguar seu tamanho. Das 11 colônias testadas, uma apresentou o tamanho de banda correto e dessa cultura foram feitos estoques de células e plasmídeos para posterior transformação em C. necator. Palavras-chave: autotrophy, cloning, colorant, gene expression Agência de fomento:Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP | |||||