| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 830-1 | ||||
Resumo:A L-asparaginase (L-ASNase) é uma enzima da família das amidohidrolases, produzida industrialmente em bactérias como Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi. Ela possui um mecanismo de ação de afinidade dupla, hidrolisando a L-glutamina (GLN) e a L-asparagina (ASN) para produzir ácido L-aspártico e amônia. É amplamente utilizada em diversas aplicações, como biofarmacêutica, agente antiacrilamida e biossensores. A produção em larga escala da L-ASNase enfrenta desafios devido à sua estrutura quaternária complexa, o que a leva a ser produzida intracelularmente para se beneficiar da estabilidade enzimática proporcionada pelo espaço periplasmático. No entanto, a capacidade limitada do espaço periplasmático resulta em uma produção reduzida de L-ASNase. Portanto, é fundamental encontrar estratégias que permitam a obtenção extracelular dessa enzima.
Uma estratégia viável é o uso de aditivos no meio de cultura, capazes de aumentar a permeabilidade da membrana celular e favorecer a liberação da L-ASNase para o espaço extracelular. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi otimizar um meio de cultura para a produção extracelular de L-ASNase dupla mutante de E. chrysanthemi em E. coli BL21 (DE3). Foram selecionados aditivos que aumentassem a atividade enzimática da L-ASNase sem prejudicar o crescimento bacteriano, e posteriormente, foram determinadas as condições ideais de cultivo. Para isso, foi realizado um projeto fatorial completo (25) para estudar o efeito de cinco aditivos (glicina, triton X-100, sacarose, n-dodecano e cálcio) na atividade enzimática da L-ASNase e no crescimento bacteriano. Os resultados da análise estatística revelaram que dois fatores, glicina e cálcio, tiveram um efeito significativo sobre a atividade enzimática e o crescimento bacteriano. Com base nessa seleção, as condições de cultivo foram otimizadas e sua sinergia com o indutor de toxicidade celular IPTG foi avaliada usando um modelo de superfície de resposta (RSM) para determinar as condições ideais para maximizar a produção de L-ASNase.
Os resultados mostraram uma atividade enzimática extracelular de aproximadamente 160.000 UL-1 e uma concentração de biomassa de 0,4 gL-1, o que representou um aumento de quase 400 vezes em comparação com a produção intracelular. Em conclusão, este estudo contribuiu para o desenvolvimento de estratégias de otimização da produção de L-ASNase extracelular. A seleção de aditivos significativos e a sinergia com o indutor IPTG resultaram em um aumento significativo da atividade enzimática sem afetar o crescimento bacteriano. Esses resultados são promissores e abrem novas perspectivas para a produção em larga escala de enzimas com estrutura complexa na forma extracelular em E. coli. Palavras-chave: extracelular, L-asparaginase, optimização, planejamento de experimentos. Agência de fomento:FAPESP-UFRO 2020/06982-3 | |||||