| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 713-2 | ||||
Resumo:Os neutrófilos (PMNs) são estudados como células exclusivas da resposta imune inata, havendo pouca participação na ativação e modulação da resposta imune adaptativa, o que pode ser explicado em parte pela dificuldade no cultivo celular e o curto período de vida que elas apresentam. Porém, há novos estudos demonstrando a participação ativa dos neutrófilos em fases da resposta imune, além das funções já documentadas exclusivamente por outras células, como por exemplo os mecanismos desempenhados pelas armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs). Estabelecer e otimizar um protocolo para isolar os PMNs é de suma importância para ampliar as possibilidades de estudo acerca das novas funções atribuídas a essas células, principalmente em caprinos, atividade em ascensão. Esse estudo tem por objetivo apresentar um protocolo para isolamento PMN caprino que obtenha uma boa taxa de viabilidade celular. As amostras de sangue periférico foram coletadas por punção da veia jugular de cabras adultas saudáveis. Foram coletados 20ml de sangue por animal em tubos de vidro contendo lítio-heparina como anticoagulante. Em condições estéreis, o sangue foi diluído em partes iguais de solução salina tamponada com fosfato de (PBS) contendo 0,02% de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e adicionado lentamente em solução de separação 3ml de Ficollpaque®. As amostras foram centrifugadas a 800 × g por 45 min ajustando a aceleração e desaceleração (3AC/1DC). O sobrenadante formado foi descartado e as células foram ressuspensas na proporção de 1ml de sangue para 10ml de solução de lise de células vermelhas (cloreto de amônio 0,155 M, bicabornato de sódio 0,012M e EDTA 0,0001M). Posteriormente, o tubo foi agitado por inversão durante 1 min para lisar os eritrócitos. Em seguida, a concentração foi imediatamente reajustada pela adição de 5 ml de Hanks’ Balanced salt solution estéril. A solução com PMNs caprinos foi lavada duas vezes (10 min, 400 × g, 4 °C, 6AC/3DC) em meio RPMI 1640 (Gibco) e ressuspensos no mesmo meio. A visualização das células PMNs foi possível através do esfregaço em lâmina das células obtidas ao final do processo de isolamento e coloração Panótico Rápido. A viabilidade foi avaliada pela exclusão do corante de azul de Trypan na proporção de 1:1 em uma câmara de Neubauer, com a contagem nos quatro quadrantes nas extremidades e realizado uma média para a obtenção do número de células. Ao executarmos o protocolo obtivemos em média um volume de 5 ml por animal de neutrófilos isolados, com uma concentração variando entre 1,9 – 4,0 x 106 cels/ml. Além disso, constatamos que a viabilidade celular foi consistentemente superior a 79%. Portanto, podemos concluir que o protocolo demonstra uma taxa satisfatória de viabilidade celular, sendo útil para utilização em outros ensaios. Palavras-chave: protocolo, resposta imune, ruminantes, sangue Agência de fomento:CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Fapemig - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais e Capes - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior | |||||