| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 337-1 | ||||
Resumo:Um dos grandes problemas enfrentados pela humanidade é a alta produção e consumo de polímeros plásticos, especialmente o polietileno tereftalato (PET). Isso causa múltiplos problemas ambientais, principalmente por conta dos bens de uso único, que são rapidamente utilizados e descartados, causando acúmulo. A descoberta de uma bactéria degradadora de PET, a Ideonella sakaiensis, permitiu a descrição de enzimas capazes de quebrar a estrutura desse polímero. Entre elas, destacam-se a PETase e MHETase. Tendo em vista que o PET se torna mais biodisponível em altas temperaturas, foi realizada uma busca de genes ortólogos à PETase de I. sakaiensis visando organismos termofílicos. O gene selecionado (D3DKA9) pertence a bactéria Hidrogenobacter thermophilus e foi sintetizado no vetor pET-28a e transformado em Escherichia coli nas cepas DH5&alpha, com a intenção de obter mais cópias do plasmídeo com o auxílio do PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen), e BL21, na qual foi realizada a indução da expressão. A proteína foi expressa por meio da adição de isopropil &beta-d-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) à cultura. Em seguida, as células foram lisadas por sonicação. Para conferir a produção da proteína recombinante, além de confirmar a banda de expressão por eletroforese em SDS-PAGE, foi utilizado o kit Pierce 6xHis Protein Tag Stain Reagent (ThermoFisher), que detecta proteínas que possuem cauda de histidina em géis de SDS-PAGE. As amostras passaram por um tratamento térmico seguido de eletroforese de SDS-PAGE, que mostrou que houve resistência da proteína de interesse a altas temperaturas. As amostras foram purificadas por cromatografia de afinidade, utilizando a resina TALON Superflow. Foi identificado atividade enzimática em p-nitrofenol acetato, p-butirato, p-palmitato e mono-4-nitrophenyl terephthalate (MpNPT), como também em bis-1,2-hidroxietil teraftalato e acetato de cinamil. Assim, o alvo do presente estudo, denominado CMBase, apresenta atividade enzimática semelhante a MHETase de I. sakaiensis. O pH ótimo da CMBase é 7 em tampão fosfato e sua temperatura ótima é 70° C, tendo estabilidade térmica entre 30 e 100° C. A estrutura tridimensional dessa enzima foi definida com difração de raios-X, com resolução de 1,5 Å, possibilitando a comparação com outras enzimas descritas envolvidas na degradação de plásticos, como PETase e MHETase de I. sakaiensis. Na estrutura 3D, pode ser visto dobramentos comuns a &alpha/&beta-hidrolases e a tríade catalítica (121Cis – 170Asp – 202His), que diverge das demais dessa superfamília. Os resultados obtidos até o momento mostram-se altamente promissores, a CMBase é solúvel e ativa em altas temperaturas, conforme o previsto. O desenvolvimento desse tipo de enzima é essencial para o avanço de tecnologias mais limpas e eficazes que visam solucionar o problema do descarte inadequado de resíduos plásticos, trazendo benefícios econômicos e ambientais. Palavras-chave: biodegradação, biotecnologia, enzimas recombinantes, sustentabilidade Agência de fomento:Universidade de Sorocaba (UNISO), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) | |||||