Resumo

INTRODUÇÃO: Estudos de otimização são essenciais para a eficiência da amplificação dos  fragmentos de DNA. As concentrações usuais dos componentes da PCR e os problemas que podem ser gerados pela maior ou menor concentração destes são vastamente discutidos na literatura. OBJETIVOS: Otimizar a reação em cadeia da polimerase para detecção do DNA de Histoplasma capsulatum var. capsulatum. E especificamente, avaliar as melhores condições para detecção do DNA desta espécie, para tal os reagentes utilizados para a realização da PCR foram testados frente a diversas concentrações e temperaturas de hibridização. MATERIAIS E MÉTODOS: As concentrações dos reagentes da PCR foram otimizadas de forma univariada, os reagentes, temperaturas e respectivas variações são apresentadas a seguir: 1) MgCl₂ (0,5; 1,18; 1,84; 2,5; 3,16; 3,82 e 4,5 mM); 2) dNTPs (50; 100; 10; 200; 250, 300 e 350 mM); 3) primers Hc III e Hc IV (0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3; 1,6; 1,9 mM); 4) Taq DNA polimerase (0,1; 0,4; 0,7; 1,0; 1,3; 1,6; 1,9 U/mL); 5) Temperatura de Hibridização (56; 59; 62; 65; 68; 71 ^oC). Em cada reação com volume final de 25 mL foi utilizado 5 mL de DNA molde (50 ng). DISCUSSÃO DOS RESULTADOS: Todas as concentrações testadas resultaram em produtos de PCR com intensidade similar pós-eletroforese. Este resultado demonstra que a reação de PCR foi capaz de gerar produtos adequados em todas as condições impostas. As temperaturas de hibridização dos primers 56^o e 59 ^oC resultaram no surgimento de uma banda inespecífica de aproximadamente 100 pb. As condições assumidas como ótimas foram: 2,5 mM de MgCl₂; 200 mM de dNTPs; 1,0 mM de cada primer; 1,0 U de Taq DNA Polimerase e 71 ^oC de temperatura de hibridização. CONCLUSÃO: A otimização da concentração dos componentes da PCR demonstrou que a reação suportou variações significativas nas concentrações destes.