Resumo

A identificação de patotipos diarreiogênicos de E. coli (DEC) despende em torno de 72-96 hs a até 120 hs, quando métodos moleculares e de aderência em células são utilizados, exigindo previamente o isolamento bacteriano. Este estudo propõe usar uma metodologia de extração de DNA bacteriano diretamente das fezes in natura, mantidas congeladas a -20ºC, para evidenciar genes de virulência por PCR para determinação do patotipo de DEC. Fezes conhecidamente negativas para E. coli enteroagregativa (EAEC) pelos procedimentos tradicionais (isolamento e identificação da espécie e detecção de gene CVD432) foram fracionadas e congeladas em igual volume. Cada suspensão, em duplicata, foi preparada e previamente contaminada com amostra de EAEC em concentração variando de 1,5x106 a 3x109 UFC/mL, ajustadas conforme escala de MacFarland. Após descongelamento foram suspensas em tampão tris-cálcio e submetidas a procedimento de extração utilizando isotiocianato de guanidina/EDTA como agentes de lise/quelante e sílica, como agente de adsorção de ácido nucléico, Amostras fecais congeladas por um período > 1 ano, que eram positivas para EAEC por PCR para gene de virulência e aderência em célula, foram utilizadas para avaliar a aplicabilidade da metodologia proposta. Após a extração, todas as amostras foram submetidas ao ensaio PCR com iniciadores para pCVD432. O limite de detecção nas fezes contaminadas foi de 5x106 UFC/g. Das amostras positivas, a EAEC foi detectada de 40% delas, o que estaria associado à carga bacteriana na amostra analisada. Métodos diagnósticos em microbiologia que sejam rápidos, além de sensíveis e específicos, são importantes para a tomada de medidas terapêuticas e profiláticas e a metodologia proposta poderá contribuir neste sentido. Além disso, estudos retrospectivos poderão ser realizados a partir de espécimes fecais mantidos congelados e ainda, auxiliaria na caracterização principalmente quando o isolamento bacteriano fosse comprometido pelo tempo de coleta e preservação da amostra. A detecção dos outros patotipos de DEC permitirá uma melhor avaliação da metodologia proposta, que apresenta um custo inferior ao de uso de kits comerciais e sensibilidade semelhante.