APLICAÇÃO DE TÉCNICAS SOROLÓGICAS E MOLECULARES PARA A TIPAGEM DE ISOLADOS CLÍNICOS DE LEPTOSPIRA INTERROGANS

Juliana Magalhães Vital-brazil (FIOCRUZ); Lívia Machry (FIOCRUZ); Rachel Leite Ribeiro (FIOCRUZ); Ilana Teruskin Balassiano (FIOCRUZ); Tatiane Mendes Varela Ramos (FIOCRUZ); Kátia Eliane Santos Avelar (FIOCRUZ); Martha Maria Pereira (FIOCRUZ)

A leptospirose é uma zoonose mundialmente distribuída que afeta homens e animais. Essa infecção tem sido classificada como uma importante doença emergente, principalmente em países com clima tropical e temperado. Porém, a prevalência da leptospirose ainda permanece subestimada, especialmente devido a dificuldades no diagnóstico clínico e laboratorial e à escassez de dados de vigilância epidemiológica. A identificação de sorovares de Leptospira spp. é essencial para estudos epidemiológicos, sendo utilizadas,  para este propósito, tanto técnicas de tipagem convencionais quanto moleculares. O objetivo do presente estudo foi utilizar as técnicas de aglutinação microscópica (MAT) com soros hiperimunes, Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) e Multiple-Locus Variable-Number Tandem Repeat Analysis (MLVA) para a tipagem de isolados clínicos de L. interrogans, comparando seu poder discriminatório e sua reprodutibilidade. Cinco espécimes isolados de hemocultura foram analisados pela técnica de PFGE, e os perfis genéticos gerados pela digestão com a enzima NotI foram comparados com os perfis de cepas de referência recomendadas pela Organização Mundial da Saúde para utilização no diagnóstico sorológico da leptospirose por MAT. Todos os isolados apresentaram 100% de similaridade, e foram classificados como pertencentes ao sorovar Icterohaemorragiae/Copenhageni. A aplicação do RAPD, uma ferramenta molecular que detecta polimorfismos no DNA genômico utilizando iniciadores randômicos, forneceu o mesmo resultado. Em nosso trabalho foram pesquisados três loci de DNA (VNTR-4, -7 e -10), conforme previamente descrito. Os produtos obtidos após amplificação foram sequenciados e alinhados. A análise de clusters revelou a presença de dois genótipos de MLVA dentre os isolados clínicos: um cluster predominante, composto por quatro isolados (16183, 16441, 19115 e 25178), e um cluster menor composto por apenas um isolado (25179), apresentando uma deleção de 11 pares de bases na segunda repetição do VNTR-4. Finalmente, para a confirmação das análises genotípicas, os isolados foram testados contra um painel de anticorpos policlonais para sorogrupos de referência. Todos os isolados foram considerados como pertencentes ao sorogrupo Icterohaemorragiae. Posteriormente, os mesmos foram testados com anticorpos monoclonais contra os sorovares Icterohaemorragiae e Copenhageni. Os isolados 16183, 16441, 19115 e 25178 foram então agrupados no sorovar Copenhageni, enquanto o isolado 25179 foi definido como sorovar Icterohaemorragiae. Dessa forma, foi possível observar que todas as técnicas foram reprodutíveis e valiosas na tipagem de isolados clínicos de Leptospira spp., sendo o MLVA e a tipagem sorológica por MAT com anticorpos monoclonais os mais discriminatórios na determinação de sorovares.