Resumo

O estudo da diversidade gen�tica de bact�rias diazotr�ficas, ou seja, fixadoras de nitrog�nio, pertencentes ao g�nero Azospirillum associadas a ra�zes de pastagens nativas do Pantanal Sul-Mato-Grossense, possibilita conhecer a popula��o de diferentes tipos de bact�rias e assim aplicar t�cnicas sustent�veis no melhoramento de pastagens, principalmente de nativas. Uma das utiliza��es da t�cnica de ARDRA (An�lise de restri��o do DNA ribossomal amplificado) � na identifica��o e agrupamento de isolados de esp�cies diferentes. A an�lise foi feita em 25 bact�rias, mais duas estirpes tipo de Azospirillum brasilense (BR11001) e Azospirillum lipoferum (BR11080), usadas para posterior compara��o dos perfis de restri��o dos isolados caracterizados morfologicamente como pertencentes ao g�nero Azospirillum. Para a extra��o de DNA bacteriano, as bact�rias foram submetidas a um crescimento de 48 horas em meio l�quido DYGS, e posteriormente, realizou-se a extra��o do DNA utilizando kit de extra��o PureLinkTM Genomic DNA (Invitrogen), seguindo o protocolo recomendado no produto. Para rea��o de PCR (rea��o em cadeia da polimerase) utilizou-se iniciadores espec�ficos para o gene 16S DNAr , Y1(5`- TGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGC �3`) e Y3 (5`- CTAGACCCCACTTCAGCATTGTTCCAT �3`) cujo o produto amplificado � de 1450 pares de base. A rea��o de amplifica��o para um volume de rea��o de 50 uL foi feita utilizando tamp�o de enzima 1X em rela��o ao volume de rea��o, 2,0 mM de MgCl2, 200�M de dNTP, 0,12 �M de primer Y1 e de primer Y2, 1,0 U de Taq DNA polimerase (Ludwig). As condi��es de rea��o foram: 1 etapa inicial de desnatura��o ( 93�C por 2 minutos), seguido por 35 ciclos intermedi�rios (93�C por 45 segundos, 62�C por 45 segundos, 72�C por 2 minutos) e 1 etapa final de extens�o a 72�C por 5 minutos. O amplicon resultante foi clivado com as enzimas de restri��o Alu I e Rsa I. Atrav�s das an�lises feitas atrav�s de uma matriz de similaridade tipo 1, utilizando o coeficiente Jaccard, tivemos os seguintes resultados: os isolados tem 63% de diferen�a com rela��o as estirpes-padr�o (Azospirillum brasilense e A. lipoferum) e s�o parecidos entre si em 80%. Formam tr�s grupos que se diferenciam entre si em 80%. O primeiro grupo apresenta 100% de similaridade entre si e cont�m 25 isolados, por�m nesse grupo h� 2 isolados que formam um grupo que difere dos demais em 10%. O segundo subgrupo � formado pelo isolado AZM 15 que � distinto do primeiro em apenas 5%. J� o terceiro grupo � formado por tr�s isolados, dois com 100% de similaridade entre os isolados HAI51 e HRI48, e a HAI6 que se distinguiu dos dois anteriores em aproximadamente 3%. H� pouca similaridade entre os isolados, por�m a t�cnica permitiu agrupar em grupos distintos.